باکتری های محرک رشد گیاهی به عنوان یکی از راههای افزایش رشد گیاه شناخته میشوند. امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزمها انواع مواد (از جمله اكسین، سیتوكینین، جیبرلین و سیدروفورها) را به محیط اضافه می کنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. هدف از این تحقیق بررسی اثرات دو باکتری محرک رشد گیاهی بر روی تکثیر گیاه پپرومیا از طریق کشت بافت بود. آزمایش به صورت طرح فاکتوریل در قالب طرح پایه کاملا تصادفی با سه تکرار اجرا شد. فاکتور باکتری محرک رشد شامل سطوح: 0: شاهد (بدون باکتری)، 2: Azospirillum lipoferrum، 3:Pseudomonas fluorescent و فاکتور هورمون شامل: 0: بدون هورمون، 1: سطح هورمون برابر با 5/1 میلیگرم در لیتر IAA و 1 میلیگرم در لیتر 2IP و 2: مقدار هورمون دو برابر غلظت قبلی بودند. قبل از کشت مقدار 08/0 میلی لیتر از کشت مایع باكتریها، بر روی محیط کشت تلقیح شد و سپس جوانههای پپرومیا در محیطهای مذکور کشت شدند. بعد از گذشت 4 هفته از کشت، جوانههای کشت شده گیاه پپرومیا به اندازه کافی رشد کرده و قابل انتقال به خاک شدند. قبل از انتقال گیاهچههای جوان به گلدان و بعد از طی کردن مراحل سازگاری اندازه گیری صفات مورد نظر انجام شد. نتایج نشان داد در آزمایش درون شیشه ای اثر متقابل هورمون و باکتری بر کل طول ریشه و میانگین طول ریشه معنیدار بود. تیمارAzospirillum بدون هورمون دارای بیشترین طول ریشه بود و اختلاف معنی دار با دیگر تیمارها داشت. اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنیدار بود. مشاهده شد تلقیح ریزنمونهها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنیدار طول متوسط شاخههای باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاری، اثرمتقابل هورمون و باکتری بر تعداد برگ، توسعه برگی و وزن خشک و اثر باکتری بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ریشه و وزن خشک معنیدار بود. در کل تلقیح با باکتری تاثیرات مثبتی بر تعداد برگ، توسعه برگی، طول شاخه و طول ریشه داشت. ولی تاثیر منفی تلقیح باکتری بر وزن تر و خشک مشاهده گردید. افزایش سطح هورمون تاثیر مثبت بر طول کل طول ریشه داشت.
کلمات کلیدی: کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فیتوهورمون، پپرومیا.
1-1 گیاهشناسی پپرومیا
گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae میباشد. این جنس دارای بیش از ۱۰۰۰ گونه مختلف از گیاهان همیشهسبز بالارونده است که اغلب آنها برگهای زیبایی دارند. گونه مذکور بومی نواحی استوایی آمریکا بوده و گیاهی است بسیار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ۸ تا ۲۵ سانتیمتر میرسد. برگهای آن بسیار زیاد و قلبی شکل میباشند که از قسمت مرکزی گیاه خارج میشوند. برگهای پپرومیا صورتی کمرنگ میباشد. گلها به رنگ سفید و به شکل گل آذین سنبله مانند و به طول ۱۲ تا ۱۵ سانتیمتر هستند و از اوایل بهار تا اواخر پاییز به چشم میخورند. این گیاه به نور متوسط، حرارت زیاد، خاک همیشه مرطوب، رطوبت ۵۰ تا ۹۰ درصد و خاک قلیایی احتیاج دارد. کود مورد نیاز این گیاه را میتوان به میزان ۲ گرم در لیتر، هر دو هفته یکبار از فروردین تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کریمی، 1390).
1-2 نگهداری گیاه پپرومیا
پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگهای چرمی شکل و قاشقی (شکل1-1)، این گیاه دارای نیاز آبی کم (بسته به شرایط محیط) میباشد، و همچنین نیاز نوری کمی دارد و سایه آپارتمان را به خوبی تحمل می کند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهی زیباست. این گیاه اگرچه رشد سریعی ندارد، ولی در هر شرایطی در آپارتمان پرورش مییابد. معمولا آنها را در تراریوم و باغ شیشه ای یا مجموعهی گلهای یک سبد پرورش میدهند. با توجه به شکل ظاهری و نحوه رشد آنها را به سه گروه تقسیم نموده اند: گروه اول: بوتهای که دارای دمبرگهای قرمز هستند، بعضی نیز برگهای گوشتی و قلبی شکل دارند، گروه دوم: دارای ساقههای بلند و قرمز رنگ هستند و بعضی ساقههای گوشتی دارند و لبه برگها ارغوانی است و گاه سطح برگ با موهای بسیار ظریفی پوشیده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست یا قیم بسته میشوند و بالا میروند، با اینکه از گلدان آویزان میشوند و دارای ساقههای قرمز و بسیار ظریف نقرهای و بعضی دارای برگهای سبز آبدار هستند و بخصوص برای گلدانهای آویز بسیار مناسبند. گیاه پپرومیا یک ساقه گلدهنده با شاتونهای سبز رنگ تولید می کند که ارزش زینتی ندارد، زمانی که این گیاه به گل میرود، کیفیت برگها و زیبایی آن کمتر می شود، با حذف ساقههای گلدهنده میتوان گیاه را مرتب به حالت رویشی و نونهالی مشاهده کرد. این گیاه به سرمای زیاد مقاومت ندارد و حداکثر می تواند در زمستان 15 درجه سانتی گراد را تحمل نماید و در فصل رشد دمای 24 تا 30 درجه برای آن بسیار مناسب است. این گیاه در زیر تابش اشعه فلورسنت پژمرده می شود و نیاز چندانی به آب ندارد و همیشه مقدار زیادی آب در برگهای آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بین دو آبیاری باید کاملا خشک شود، ولی نباید آبیاری آنقدر به تعویق افتد که برگها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نیاز دارد و مقدار آبیاری باید بسیار کمتر باشد، ریشه آن سطحی است و گسترش چندانی ندارد و در هوای آلوده، زرد و خشک می شود، در صورت آب دادن زیاد اطراف یقه ساقه، موجب پوسیدگی اطراف آن می شود. میزان رطوبت هوای لازم برای این گیاه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکههایی بر سطح برگ ظاهر میشوند، برگ را بیحس می کنند و میافتد. هر دوماه یکبار سطح خاک گلدان را باید خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضای آزاد در محلی سایه قرار دهید تا حالت طبیعی خود را به دست آورد. هر اندازه قابلیت نفوذ خاک این گیاه بیشتر باشد ریشه و ساقه از پوسیدگی محفوظ خواهد بود. بهتر است برای تهیه خاک گلدان این گیاه یک قسمت پیت بعلاوه یک قسمت ماسه به همراه یک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداری ماسه و سنگریزه بریزید، زمان مناسب برای تغییر گلدان این گیاه فصل بهار است. پپرومیای ابلق یا سفید با قلمههای بذر و ساقه تکثیر می شود و پپرومیای سبز با قلمههای برگ و ساقه تکثیر می شود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمههای یک ساله برای گیاه استفاده نمود و برای این کار قلمه را به میزان 4 تا 5 سانتیمتر در ماسه شسته فرو برده و در محلی که دمای آن 18 درجه باشد در تاریکی قرار میدهند. در مورد انواع گوشتی آن برگ را روی سطح ماسه خوابانیده و روی آن ماسه شسته میریزند، پس از مدتی در انتهای رگبرگها ریشه ظاهر می شود (کریمی، 1390).
1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
تكنیک كشت بافت گیاهی نقش كلیدی در انقلاب سبز دوم دارد كه در این انقلاب تغییرات ژنی و بیوتكنولوژی جهت پیشرفت كیفیت و كمیت محصولات زراعی بكار میروند. این تكنولوژی برای محدوده وسیعی از گیاهان زراعی و گونه های درختی جهت حل مشكلات بكار گرفته شده است. این روش بواسطه تلاش های مداوم و پیگیر تعداد زیادی از دانشمندان كه كارهای پایهای انجام دادهاند، ممكن شده است. كشت بافت گیاهی اصطلاحی است كه بطور كلی برای رشد درون شیشه ای و عاری از بیماری گیاه بر روی محیط مغذی بكار میرود. این تكنولوژی بر سه اصل اساسی استوار است (باقری و همکاران، 1381):
- قسمتی كه باید از گیاه اصلی جدا شود.
- ریزنمونه باید در شرایط شیمیایی (محیط كشت) و فیزیكی (محیطی) تعریف شده نگهداری شود.
- شرایط استریل و عاری از آلودگی باید حفظ شود
شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)
دانش امروزی اجازه بكارگیری هر قسمت از گیاه را برای شروع كشت میدهد. قسمتی از گیاه كه برای این منظور بكار میرود ریزنمونه نامیده می شود. انتخاب هر قسمت از گیاه با توجه به هدف از كشت متفاوت است. مواد و نمونههایی كه از محیط خارج جمعآوری و به آزمایشگاه آورده میشوند، در حین انتقال، بهتر است در شرایط مناسب نگهداری شوند تا فعالیتهای كاتابولیكی به حداقل برسد. مواد بطور كامل باید با آب جاری و مایع شوینده شستشو داده شوند (مانند تویین-80[1])، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ریزنمونه مراحل استریل انجام شده و سپس كشت انجام می شود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشه ای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه می شود، این روش به عنوان یکی از شاخههای زیستفناوری، کاربرد گستردهای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت
می شود. در این نوع کشت، شرایط به گونه ای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشه ای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
در سال 1838 شوان و شیلدن[2] نظریۀ توتیپوتنسی[3] را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، می تواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعدها دانشمند آلمانی، هابرلند[4] (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلولهای کشت شده مناسب باشند، سلولهای کشت شده میتوانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاش های او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافتهای گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلولها تأثیر نمیگذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنینهای مصنوعی را از سلولهای رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمونهای گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیتآمیز بافتهای گیاهی، توسط وایت[5] در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقیتآمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیمکننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشه ای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیمکننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونه ها، ممکن است کار اولیه مورل[6] روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ[7] در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمکهای معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).
1-4 ترکیبات محیطهای کشت
محیط کشت یکی از مهمترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیطهای کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر مییابد. برای نمونه روشهایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاختهها یا بافتها نیازمند محیطهای کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاختهها و بافتها برای رشد میباشد. برای نمونه محیطهای کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونههای بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچههای باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا می کنند. از سوی دیگر، کشتهای تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاختهها را قادر میسازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گازها تسهیل شود. تمام یاختههای گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیمکننده های رشد گیاهی (هورمونها) هستند. ترکیبات محیطهای کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندیها را منعکس میسازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار میروند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را میتوان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیمکننده های رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1389).
1– 4 – 1 مواد غیر آلی
عناصر غذایی غیر آلی، عناصر معدنی هستند و معمولا بر اساس غلظتهای ضروری به دو گروه تقسیم میشوند: عناصر پرمصرف که در مقادیر زیاد (غلظتهای میلیمول) و عناصر کممصرف که تنها در غلظتهای بسیار پایین (میکرومول) ضروری میباشند. عناصر پرمصرف شامل: نیتروژن، گوگرد، فسفر، کلسیم، منیزیم، پتاسیم و عناصر کممصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، ید، منگنز، مولیبدن و روی هستند. عناصر غذایی آلی در حالی که گیاهان سبز خودپرور هستند، ولی بیشتر سیستمهای کشت حداقل در مراحل اولیه، خودناپرور میباشند و به یک منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند. کشتها برای آغاز توسعه کلروپلاستها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده میشوند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی، کشتهای گیاهی ممکن است به مولکولهای آلی پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند میباشند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).
1– 4– 2 منبع کربن
قندها برای تامین کربن و انرژی به محیطهای کشت گیاهی افزوده میشوند. ساکارز متداولترین قند مورد استفاده در محیطهای کشت گیاهی است، ولی گلوکز، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیطهای کشت مورد استفاده قرار میگیرند. علاوه بر نقش متابولیکی آن، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگهدار عمل می کند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک می کند (شریفی و همکاران، 1389).