شیر و فرآورده های آن از زمان های گذشته از منابع مهم جهت تغذیه بشر بوده است و هم اکنون نیز در تمامی جوامع و اقشار، بخش مهمی از غذای روزانه انسان را تشکیل می دهد. شیر و فرآورده های آن به علت دارا بودن ترکیبات مختلف غذایی، محیطی مناسب و مطلوب جهت رشد و تکثیر میکروارگانیسم ها[1] می باشند . در صورت عدم رعایت اصول بهداشتی در طول تولید ، فرآوری ، بسته بندی و حمل و نقل ، مصرف شیر و فرآورده های آن می تواند برای سلامتی انسان و بهداشت جامعه خطر آفرین باشد . قارچ ها (کپک ها و مخمرها ) از جمله میکروارگانیسم هایی می باشند که می توانند در شیر و فرآورده های آن رشد کرده و تولید توکسین[2] نماید .

قارچ ها به دو صورت مستقیم و غیرمستقیم باعث آلودگی شیر و فرآورده های آن می شوند . این گروه از ارگانیسم ها[3] قادر هستند در طول مدّت رشد خود بر روی مواد غذایی ، علاوه بر کاهش ارزش غذایی ، متابولیت های ثانویه ای[4] به نام مایکوتوکسین[5] تولید کنند . مایکوتوکسین ها دارای اثرات سمّی[6] ، سرطان زایی[7]، ناقص الخلقه زایی[8] ، کاهش رشد و اثرات جهش زایی[9] بر روی موجودات زنده می باشند. وجود قارچ ها و متابولیت های آنها بصورت باقیمانده در شیر و فرآورده های آن می تواند برای انسان خطرساز باشد . از این رو ، بررسی آلودگی های قارچی شیر و فرآورده های آن موضوعی است که باید بطور جدّی مورد توجه قرار گیرد . قارچ ها می توانند مواد قندی ، پروتئینی ، چربی ها ، اسید های آلی و غیره را مورد مصرف قرار دهند و بدین ترتیب با ایجاد تغییر در اجزاء متشکله ماده غذایی ، باعث فساد آن می شوند . همچنین با ایجاد سموم باعث مسمومیت خفیف یا شدید در مصرف کنندگان ماده غذایی آلوده مانند شیر و فرآورده های آن می شوند و در دراز مدت خواص سرطانزایی و جهش زایی خود را در انسان بروزمی دهند . خطرناک ترین سمّ قارچی شناخته شده آفلاتوکسین B₁ است . اگر جیره غذایی دام های شیری به این سمّ آلوده گردد و توسط حیوان مصرف شود در بدن حیوان در اثر یک سری فعل و انفعالات شیمیایی تغییر پیدا کرده و بصورت آفلاتوکسین M₁ وارد شیر می شود و اگر شیر آلوده به آفلاتوکسین M₁ توسط انسان مصرف شود اثراتی شبیه آفلاتوکسین B₁ایجاد خواهد کرد.

از آنجائیکه در حال حاضر جلوگیری از آلودگی شیر و فرآورده های آن به سموم قارچی به طور کامل امکان پذیر نمی باشد ، لذا اکثر کشورها برای بعضی سموم در خوراک انسان و حیوان حدود استانداردی را قائل شده اند و در مورد آفلاتوکسین ها این استاندارد ها به مراتب بیشتر از سایر سموم قارچی اعمال می گردد.

در مجموع با توجه به شرایط نامناسب تغذیه ای در دامداری های کشور ما ، چه از زمان کاشت و برداشت محصول تا حتی نگهداری نامناسب آن در خود دامداری ها ، و نیز با توجه به تولید بالای شیر و فرآورده های آن در کشورمان که از لحاظ آمار و ارقام اقتصادی بسیار با ارزش می باشد ، لذا اهمیت موضوع شناسایی و نحوه برخورد با فرآورده های آلوده ضروری بنظر می رسد . امید است که در ایران مسئولان ذیربط تمهیدات وسیعی را در این مورد به کار گیرند .

در این تحقیق تعدادی نمونه شیر خام گاو و گاومیش در شهرستان شوش استان خوزستان را مورد بررسی قرار داده و میزان آلودگی آن ها به آفلاتوکسین M₁ با روش الیزا سنجیده خواهد شد.

بنابراین اهداف کلی این طرح شامل:

1- تعیین وضعیت آلودگی شیرخام گاو و گاومیش موجود در شهرستان شوش به آفلاتوکسین M₁

2- مقایسه مقدار آلودگی شیرهای آلوده با استانداردهای موجود

3- مقایسه میزان آفلاتوکسین M₁ بین شیر خام گاو و گاومیش در فصل ها و ماه های مختلف

فصل دوم

ی بر تحقیقات انجام شده

2-1- کلیاتی بر مایکوتوکسین ها

واژه مایکوتوکسین که دارای ریشه یونانی می باشد از دو کلمه Myhez به معنی قارچ و Toeikonبه معنای تیر سمی تشکیل شده است . انواع مواد غذایی مورد مصرف انسان و حیوانات و محصولات مختلف کشاورزی در زمان های مختلف کاشت ، داشت و برداشت و حتی در زمان انبار شدن در معرض آلودگی به مایکوتوکسین ها می باشند . این متابولیت های ثانویه که توسط قارچ های مولد در شرایط محیطی مختلف بر روی مواد غذایی ایجاد می گردند با توجه به اثرات بیولوژیکی[10] و توکسیکولوژیک[11] نامطلوب خود از قبیل مسمومیت حاد ، سرطان زایی ، جهش زایی ، ناقص الخلقه زایی ، استروژنیکی[12] و غیره جزء مسموم کننده های واقعی به حساب می آیند. مجموع علایم مسمومیت که در اثر مصرف مایکوتوکسین ها بوسیله موجودات زنده بالاخص انسان در آنها مشاهده می گردد اصطلاحاً به عنوان مایکوتوکسیکوز[13] شناختهمی شود (وان اگموند[14]،1989).

شناخت مایکوتوکسیکوز سابقه طولانی دارد و احتمالاً اولین مسمومیت قارچی شناخته شده ارگوتیسم[15]می باشد که در سال 1853 رخ داده است . این بیماری سبب نکروز[16] و گانگرن[17] در اندام ها می شود که در قرون وسطی در اروپا از آن به عنوان آتش مقدس[18] نام می برند . مسئول ایجاد بیماری مصرف غلات آلوده به قارچ کلاویسپس پورپورا[19] بوسیله حیوانات مبتلا بود (مورگان و همکاران[20] ،1990).

مسمومیت قارچی دیگری بنام [21]ATA در سال 1953 اتفاق افتاد که بطور جدی جمعیت انسانی را مورد آسیب قرار داد . این بیماری در انسان به اشکال مختلف دیده می شود که از آن جمله می توان به لکوپنی[22] ، زخم های نکروتیک محوطه دهانی ، سپتی سمی ، اسهال خونی و غیره اشاره کرد . این بیماری با دریافت حبوبات و غلات کپک زده زمستانی در برخی از نواحی روسیه در جنگ جهانی دوم اتفاق افتاد . قارچ مسئول ایجاد این بیماری از گونه های فوزاریوم[23] و کلادوسپوریوم[24] بود (وان اگموند ، 1989).

در سال 1956 در ژاپن نیز کینوزیتا و شیکاتا[25] اعلام نمودند که مصرف برنج زرد باعث ایجاد علائمی نظیر استفراغ ، تشنج و فلجی بالا رونده در انسان می شود که می تواند ظرف مدت 3 روز منجر به مرگ شود . قارچ مولد سم در برنج زرد از جنس پنی سیلیوم[26] بود (کیوراتا و همکاران[27] ،1968).

تا سال 1960 علیرغم بیماری های گزارش شده اهمیت زیادی به مایکوتوکسیکوزیس داده نشد و تنها آنرا بعنوان بیماری ناشی از اهمال[28] می دانستند . اما زمانیکه بیماری همه گیری در بوقلمون های انگلستان رخ داد این تفکر تغییر پیدا کرد . این بیماری که درمدت چند ماه سبب تلفات 000/100 قطعه از بوقلمون ها گردید از آنجا که ناشناخته بود بیماری X نامیده شد (سرگینت[29] ،1971).

ضررهای اقتصادی سبب گردید تا کوشش بسیاری در جهت بررسی علت بیماری صورت گیرد . طی تحقیقات بعمل آمده مشخص گردید که عامل سمی بوجود آورنده بیماری توسط دو قارچ آسپرژیلوس فلاووس[30] و آسپرژیلوس پارازیتیکوس[31] تولید شده است که نام آنرا آفلاتوکسین[32] نهادند . کلمه آفلاتوکسین مشتق شده از ابتدای کلمات آسپرژیلوس و فلاووس و سپس توکسین به معنای سم است(مونتانیوهمکاران[33]،1998). قارچ های مولد آفلاتوکسین به میزان زیاد در هوا ، خاک و محیط اطراف ما وجود دارند . هرگاه شرایط نگهداری اغذیه مناسب نباشد ، وجود رطوبت بالا و گرمای مناسب ، رشد و تکثیر سریع قارچ ها را سبب می شود . آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس از مهمترین قارچ های آلوده کنند مواد غذایی هستند که در بروز مسمومیت ها نقش انکار ناپذیری دارند . این قارچ ها نقش مهمی در فساد گندم ، ذرت ، جو ، سویا ، آرد ، سبوس ، نان و سایر مواد غذایی دارند (میرارانی و همکاران[34]،1997). در میان مایکوتوکسین ها ، آفلاتوکسین هایی که توسط کپک آسپرژیلوس مخصوصاً انواع آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس تولید می شوند ، بخاطر سمیت زیاد برای انسان و مهره داران اهمیت زیادی دارند(یونوسان[35]،2006 ؛زیندین و همکاران[36]،2007). چهار نوع اصلی آفلاتوکسین به نام های B₁ ، B₂ ، G₁و G₂ وجود دارند . بخش قابل ملاحظه ای از آفلاتوکسین های بلع شده ظرف 48 ساعت در شیر دیدهمی شوند و بخشی نیز در کلیه ، کبد و عضلات تجمع می یابند (ایلی[37] ،1996؛سایتانو[38] ،1997).

آفلاتوکسین ها در مجاورت اشعه ماوراءبنفش (UV) دارای فلوئورسانس می باشند(رکنی ،1381). تحقیقات بعدی در مورد سم مذکور توسط روش کروماتوگرافی روی لایه نازک ( TLC )[39] انجام پذیرفت . با بهره گرفتن از این روش مواد جدا شده از رشد کپک آسپرژیلوس فلاووس بصورت چهار نقطه مجزا با درخشش آبی ( انواع B₁ و B₂ ) و سبز (انواع G₁ و G₂ ) مشخص گردید .بنابراین نام این ترکیبات را آفلاتوکسین نهادند که شامل آفلاتوکسین های B₁ ، B₂ ، G₁و G₂بود (مونتانی و همکاران ،1998).

گروه B در مجاورت نور اشعه ماوراءبنفش به رنگ آبی در می آیند و آفلاتوکسین های گروه G با رنگ طرد مایل به سبز (زنگاری)مشخص می شوند . آفلاتوکسین ها باعث آلودگی بسیاری از مواد غذایی از جمله شیر و فرآورده های آن می گردند . علاوه بر آفلاتوکسین ها ، مایکوتوکسین های دیگری نیز طی بیست سال اخیر کشف شده اند (حدود 300 نوع ) که جنس های مختلف قارچی مانند پنی سیلیوم[40] ، آسپرژیلوس و فوزاریوم[41] در تولید آنها نقش دارند . در این رابطه می توان به سمومی نظیر ایسلندیسین[42] ، پاتولین[43] ، سیتروویریدین[44] و زیرالنون[45] اشاره کرد . کلیه سموم فوق می توانند کم یا بیش ایجاد مسمومیت های کبدی و یا در درازمدت ایجاد تومورهای کبدی بنمایند (رکنی ، 1381).

مطالعات مختلف نشان داده اند که شیر گاوهایی که بادام زمینی آلوده به آفلاتوکسین های B₁ و B₂ مصرف کرده اند حاوی مواد فلوئورسانسی به نام آفلاتوکسین های M₁ و M₂ می باشد . آفلاتوکسین های M₁ و M₂ که از نظر ساختمانی به آفلاتوکسین های B₁ و B₂ بسیار شباهت دارند ، در اثر هیدروکسیلاسیون[46] آفلاتوکسین های B₁ و B₂ در بدن حیوان ایجاد و از راه شیر ، ادرار و مدفوع دفع می شوند (کان کان[47] ،1988).

آفلاتوکسین M₁ موجود در شیر در حقیقت متابولیت سرطانزای آفلاتوکسین B₁ می باشد و از شیر گاوهایی که با غذاهای آلوده به آفلاتوکسین B₁تغذیه شده اند قابل جداسازی است. آفلاتوکسین M₁نسبت به حرارت پاستوریزاسیون مقاوم بوده و بدون تغییر وارد فرآورده های شیر می گردد و مصرف آن در انسان با بروز سرطان کبدی و افزایش خطر ابتلا به آن همراه است(کان کان ،1988 ؛ هژیر و همکاران[48]،2009 ؛ نماتی و همکاران[49]،2010 ؛ سایتانو ،1997). بنابراین آلودگی انسان با آفلاتوکسین M₁ موجود در شیر و محصولات لبنی بسیار خطرناک است . آفلاتوکسین را می توان یکی از سموم قوی در ایجاد سرطان دانست (رکنی،1381؛کان کان ،1988 ؛هژیر و همکاران[50]،2009 ؛ نماتی و همکاران[51]،2010). سمیت انواع آفلاتوکسین متفاوت بوده و نوع B₁ آن سمی تر از سایرین است و مواد غذایی انسان و خوراک دام در صورت آلودگی مخاطراتی را برای مصرف کنندگان در برخواهند داشت (رکنی ، 1381).

2-2-انواع قارچ های مولد آفلاتوکسین

آفلاتوکسین ها احتمالاً توسط سه گونه آسپرژیلوس فلاووس ، پارازیتیکوس و به مقدار کمتر آسپرژیلوس نومیوس[52] تولید می شوند ، که اینها گیاهان و فرآورده های گیاهی را آلوده می کنند(فائو[53] ،2002).

آسپرژیلوس فلاووس ، آفلاتوکسین هایB₁ و B₂ را تولید می کند ، در حالیکه آسپرژیلوس پارازیتیکوس و نومیوس آفلاتوکسین های G₁ و G₂ را هم تولید می کنند . (علاوه برB₁ و B₂) . آفلاتوکسین های M₁ و M₂ ، متابولیت های هیدروکسیله آفلاتوکسین های B₁ و B₂ هستند که در شیر و فرآورده های آن که از دام هایی که از آذوقه آلوده تغذیه کرده اند ، دیده می شوند . بعد از کشف علت بیماری X در سال 1960 تلاش های زیادی در راه شناسایی قارچ های مولد سموم و بالاخص آفلاتوکسین ها انجام پذیرفت . آسه وِدا[54] و همکارانش در سال 1994 بر روی 90 نمونه ذرت سیلو شده مطالعه کردند که عمده قارچ های نظیر آسپرژیلوس ، پنی سیلیوم ، فوزاریوم ،آکرومونیوم[55] و کلادوسپوریوم جدا گردیدند . در این میان آسپرژیلوس فلاووس نسبت به سایر گونه های آسپرژیلوس بیشتر دیده شد اما تنها توانسته بود آفلاتوکسین های B₁ و B₂را تولید نماید . در حالیکه آسپرژیلوس پارازیتیکوس تمام آفلاتوکسین های B₁ و B₂ و G₁ و G₂ را تولید کرده بود . بهرحال مهمترین قارچ هایی که توانایی تولید آفلاتوکسین را دارند ، آسپرژیلوس فلاووس و در وهله بعدی آسپرژیلوس پارازیتیکوس می باشند (وان اگموند ،1986؛ فائو ،2002).

در سال 1980 بنت[56] و همکارانش در شیر خشک هایی که جهت مصرف نوزادان تهیه می شدند آسپرژیلوس پارازیتیکوس تلقیح نمودند و پس از 24 ساعت نگهداری در دمای 30 درجه سانتیگراد ، آفلاتوکسین های B₁ و G₁ در حد ng/ml 273تشکیل شده بودند (درخشانی ، 1384).

در سال 1971 کیرمیر[57] اثر میزان رطوبت را بر روی تولید آفلاتوکسین در 20 درجه سانتیگراد توسط آسپرژیلوس پارازیتیکوس و آسپرژیلوس فلاووس در شیر خشک مورد مطالعه قرار داد . در شیر خشک هایی با رطوبت حدود 6 درصد آفلاتوکسین های B₁ و G₁به مقدار بیش از 192 میکروگرم در هر گرم بدست آمد . مسئله مهم تشکیل آفلاتوکسین B₁ و G₁در حد کمتر توسط پنی سیلیوم پوبرولوم در شیر خشک ها رطوبت دیده بود .

در مطالعات دقیقتر بعدی با شیر خشک های رطوبت دیده ای که آسپرژیلوس پارازیتیکوس بداخل آنها تلقیح شده بود و در درجه حرارت های 20-1 درجه سانتیگراد بمدت 14 روز نگهداری شده بودند ، نشان داد که آفلاتوکسین G₁با مقدار 2/87 میکروگرم در هر گرم و در غلظت های پایین تر آفلاتوکسین های B₁ ،B₂ و M₂ و G₂ در 20 درجه سانتیگراد تشکیل شدند و این در حالی بود که حتی در دمای 1 درجه سانتیگراد ، آفلاتوکسینG₁با مقدار 58/0 میکروگرم در هر گرم مشاهده گردید (درخشانی ، 1384).