انگلیسی………………………………………………………………………………………………………………………………………………….87.

 فهرست جداول

جدول شماره 1-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت رده های سلولی GC1-spg با غلظتهای مختلف گوسیپول……………50.

جدول شماره 2-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول در با گروه کنترل در رده سلولی GC1-SPG توسط آزمونMTT……..51.

جدول شماره 3-3 : نتایج آزمون MTT پس از مجاورت رده های سلولی SFTF-pI₄₃ با غلظتهای مختلف گوسیپول…………53.

جدول شماره4 -3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول رده سلولی SFTF-pI₄₃توسط آزمونMTT …………..54.

جدول شماره 5-3 : میانگین درصد حیات سلول های SFTF-PI₄₃و GC1-SPG پس از مجاورت با گوسیپول به روش رنگ‌آمیزی تریپان بلو…………………………………………………………………………………………………………………………………………56.

جدول شماره 6-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپولرده سلولی GC1-SPG با بهره گرفتن از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………..57.

جدول شماره 7-3 : مقایسه آماری سمیت گوسیپول با گروه کنترل در رده سلولی SFTF-pI₄₃ با بهره گرفتن از روش رنگ آمیزی تریپان بلو………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….59.

فهرست نمودارها

نمودار شماره 1-3 : درصدحیات سلولهای GC1-spg در مجاورت باغلظتهای توسط آزمون MTT…………………………………..52.

نمودار شماره 2-3 : در صد حیات سلولهای SFTF-PI₄₃ در مجاورت با غلظتهای گوسیپول توسط آزمون MTT…………………55.

نمودار شماره 3-3 : در صد حیات سلولهای GC1-spgپس از مجاورت با غلظتهای گوسیپول به روش تریپان بلو…………………58.

نمودار شماره 4-3 : درصد حیات سلولهای SFTF-PI₄₃ پس از مجاورت با غلضتهای گوسیپول بهروش آزمون تریپان بلو…….60.

نمودار شماره 5-3 : نحوه محاسبه زمان تقریبی دوبرابر شدن رده سلولی GC1-spg…………………………………………………………60.

نمودار شماره 6-3 : نحوه محاسبه زمان دو برابر شدن در رده سلولی SFTF-PI₄₃…………………………………………………………..61.

نمودار شماره 7-3 : تعیین IC₅₀گوسیپول توسط آزمون MTT در دو رده سلولی…………………………………………………………..61.

فهرست تصاویر

تصویر شماره 1-1 : طرحی از تکثیر اسپرماتوگونی ها و بازسازی سلولهای بنیادی در جوندگان……………………………………10.

تصویر شماره 2-1 :گیاه پنبه دانه……………………………………………………………………………………………………………………….16.

تصویر شماره 3-1 : ساختار گوسیپول…………………………………………………………………………………………………………………18.

تصویر شماره 1-2 : نمایی از سلولهای GS1-spg………………………………………………………………………………………………..37.

تصویر شماره 2-2 : نمایی از سلولهای، SFTF-PI₄₃ …………………………………………………………………………………………..37.

تصویر شماره 3-2 : نحوه کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه……………………………………………………………………………………41.  

تصویر شماره 4-2 : پودر گوسیپول استیک اسید   ……………………………………………………………………………………………….43.    

تصویر شماره 5-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول……………………………………………………………………………………………………43.

تصویر شماره 6-2 : غلظتهای مختلف گوسیپول برای انجام آزمون MTT ……………………………………………………………….46.

تصویر شماره 7-2 : اضافه شدن MTT بعد از24 ساعت به چاهکهای پلیت……………………………………………………………….46.

چكیده

 ارزیابی سمیت گوسیپول بر روی دو رده سلول های بنیادی بافت بیضه

 سابقه وهدف:

گوسیپول یک ترکیب پلی فنلی استخراج شده از گیاه پنبه دانه است. در حال حاضر این گیاه به عنوان مکمل غذایی برای تغذیه نشخوار کنندگان استفاده می شود. بعضی از مطالعات حاکی از آن است که مصرف بیش از اندازه گوسیپول، باعث اختلال در فرایند اسپرماتوژنزیس می شود. با توجه به اینکه ممکن است این ماده بر روی سلولهای ژرمینال تاثیر بگذارد، لذا در این پژوهش، به بررسی اثر آن بر روی دو رده سلول بنیادی بافت بیضه موش GC1-spg (حیوان غیرنشخوار کننده ) و بافت بیضه گوسفند SFTF-PI₄₃ (حیوان نشخوار کننده) پرداخته شد.

روش کار:

سلولهای GC1-spg و SFTF-PI₄₃، در محیط کشت RPMI1640 به همراه 10%  FBSو همچنین پنی سیلین و استرپتومایسین کشت داده شدند. سپس از هر رده سلولی، تعداد 10⁴x5 سلول در چاهک های دو پلیت 24 خانه کاشته شد. پس از تهیه محلول گوسیپول اسید استیک در 4 غلظت 25/1، 5/2، 5 و 10 میکرومولار به مدت 24ساعت با رده­های سلولی ذکر شده مجاورت پیدا کرده و انکوبه شدند. به منظور بررسی اثر گوسیپول استیک اسید بر روی رشد سلولها، از روش MTT asseyو همچنین جهت بررسی حیات سلولی از روش رنگ آمیزی Trypan Blue استفاده گردید. آنالیز داده ­ها توسط آزمون یک طرفه ANOVA و T-Test با بهره گرفتن از نرم افزار SPSS انجام شد.

یافته­ ها:

در این مطالعه، میزان سمیت گوسیپول، در غلضتهای 5/2، 5 و 10 میکرومولار نسبت به گروه کنترل، در هر دو رده سلولی دیده شد، که از نظر آماری معنی دار بود (P<oo1). میزان سمیت گوسیپول در غلظت 25/1 میکرومولار، از نظر آماری معنی دار نبود.

نتیجه گیری:

اثر سمیت گوسیپول استیک اسید بر روی دو رده سلولی بافت بیضه GC1-spg , SFTF-PI₄₃))، حاکی از کاهش توانایی حیات سلولهای بنیادی در روند اسپرماتوژنزیس بوده که وابسته به دوز است.

واژه­ های­ کلیدی: گوسیپول، توکسیسیتی، GC1-spg ، SFTF-PI₄₃ ، بافت بیضه .                          

 بیضه:

بیضه، دارای یک کپسول ضخیمی است، که توسط بافت همبند متراکمی به نام تونیکا آلبوژینه آ، احاطه شده است. همچنین یک کیسه سروزی از خارج آن را احاطه کرده است که تونیکا واژینالیس نام دارد. بیضه شامل 250 بخش هرمی به نام لوبول های بیضه بوده که در هر لوبول 1 تا 4 عدد لوله پیچ دار یا لوله های اسپرم ساز[1] در آن وجود دارد. در بین این لوله ها بافت ظریفی وجود دارد که شامل عروق خونی، لنفاوی و اعصاب و تعدادی سلول به نام سلول بینابینی (لایدیگ) است. کار مهم این سلول ها، تولید هورمون تستوسترون یا آندرروژن می باشد (6).

 سلولهای سرتولی:

سلولهای مهم دیگری در عمل کرد بیضه وجود دارند که نقش پشتیبانی،حفاظت و تغذیه اسپرماتوزوئیدهای در حال تکامل را به عهده می­گیرند، این سلولها را سرتولی می نامند. این سلولها، طویل و هرمی شکل بوده که قاعده آنها بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز و رأسشان تا مجرای لوله امتداد یافته است. سلولهای سرتولی دارای هسته ای مثلثی شکل و سیتوپلاسمی نامنظم و تعداد زیادی میتوکندری، لیزوزوم و شبکه آندوپلاسمی صاف و خشن می­باشد. این سلولها به وسیله اتصالات شکافدار به هم متصل هستند که سبب ایجاد ارتباط یونی وشیمیایی بین این سلولها می­ شود. سلولهای سرتولی در برابر شرایط نامطلوب همانند عفونت و یا قرارگیری در معرض پرتو x نسبت به سلولهای رده اسپرماتوژن، مقاومترند (6و70).

سلولهای ژرمینال :

بر روی غشای پایه لوله­های اسپرم ساز 8- 4 طبقه سلول جنسی قرار داشته که کارشان تولید اسپرماتوزوئیدها است. این­ روند را اسپرماتوژنزیس می­نامند که شامل تقسیم میتوزی، میوزی و تمایز نهایی اسپرماتیدها است (70).

اسپرماتویست اولیه :

سلولهای زایای اولیه به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تبدیل شده و از اجتماع سلولهای بنیادی، سلولهایی برای ساختن اسپرماتوگونی A که ایجاد آن به طور مشخص آغازگر اسپرماتوژنز میباشد به وجود می­آید. سلولهای A در ادامه با تقسیمات میتوزی خود تبدیل به اسپرماتوگونی B شده و این نوع اسپرماتوگونی به اسپرماتوسیت­های اولیه تقسیم می­شوند (70).

اسپرماتویست ثانویه نیز از اسپرماتویست اولیه توسط تقسیم میوزی شکل می­گیرد و در نهایت از اسپرماتوسیت ثانویه، اسپرماتید به وجود می آید (6) .

سلول بنیادی:

سلولهای بنیادی سلولهایی­اند که دو ویژگی مهم یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولها با ویژگی یکسان (خودنوزایی[2]) را دارند. این سلولها هنگامی که تقسیم می­شوند، می­توانند سلولهای تخصصی و تمایز یافته ای را ایجاد کنند (85). خود نوزایی سلولهای بنیادی، از اساسی­ترین ویژگی­هایی هستند، که این سلولها آن را کسب می­نمایند. این سلول ها ازطریق تقسیم میتوزی تکثیر یافته و تمام سلولهای دختری به وجود آمده، دقیقا شبیه به سلولهای مادری خود هستند (4و53).

تقسیم در این نوع سلولها، به دو روش متقارن و نامتقارن صورت می­پذیرد. در تقسیم متقارن شرایط به این صورت است که دو سلول دختری کاملا شبیه به سلول مادری بوده و تا زمانی که شرایط تمایز برای آن وجود داشته باشد، تقسیم ادامه می­یابد. در تقسیم نامتقارن نیز هر سلول بنیادی به یک سلول بنیادی که ویژگی­های خود نوزایی دارد و همچنین یک سلول پیش ساز که به یک سلول تخصص یافته تبدیل شده است، تقسیم می­شوند. با فراهم شدن شرایط تمایز، سلول پیش ساز متمایز می­گردد (13 و53).

این سلولهای بنیادی را می­توان به انواع همه توان، پرتوان و چند توان تقسیم نمود. همه توان، سلولهایی هستند که قادرند همه سلول ها اعم از سلول های خود فرد و یا سلولهای برون جنینی (جفت)، و بلاستومر های یک جنین دو سلولی را بسازند. سلولهای پرتوان نیز همین توانایی را داشته ولی با این تفاوت که این سلولها قادر به ایجاد سلولهای برون جنینی یعنی جفت، نیستند (73) .

در کنار این دو حالت، اگر سلولها تعداد محدودتری از انواع سلول را تولید نمایند، سلولهای چند توان نامیده می­شوند. نمونه آن سلولهای بنیادی خاصی است که در بافت بالغین وجود دارد (76). یک سری سلولهای دیگری نیز مانند unipotent, bipotent, Tripotent, ouadripoten, oligopotent وجود دارند که با توجه به توانایی شان در رشد، تبدیل به یک، دو، سه، چهار و یا چند سلول می­شوند (47). سلولهای بنیادی دارای دو منشاء جنینی و بزرگسالی هستند، سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی داخل[3] جنین در مرحله بلاستوسیت به دست می­آیند و جزء سلول های پرتوان هستند (76).

دسته دیگر از سلولهای بنیادی، سلولهای بنیادی بالغین هستند. که در بسیاری از ارگانها و بافتهای بدن شناسایی شده ­اند، که این بافتها شامل مغز، مغز استخوان، کبد، خون، رگها، ماهیچه­های اسکلتی، پوست، پالپ دندان، قلب، قرنیه، لوله گوارش، شبکیه چشم، تخمدان و بیضه هستند. این سلولها در مکان خاصی از هر بافت که جایگاه ویژه سلول بنیادی نامیده می­شوند، قرارگرفته اند(93).

اگر چه انواع مختلف سلول بنیادی در یک فرد وجود دارد، اما سلول بنیادی اسپرماتوگونی منحصر به فرد می باشد. چون تنها سلول بدن است که با تقسیم خود می ­تواند ژنها را به سلولهای فرزندان بعد از خود منتقل نماید (13). بیضه یکی از بافت هایی است که سلول بنیادی بالغ در آن وجود داشته و تکثیر و تمایز آن ها نقش مهمی در تداوم روند اسپرماتوژنیس ایفا می کند(2). سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی،[4] (SSCS) بر روی غشای پایه لوله اسپرم ساز در انسان و یا در حیوانی مثل موش بالغ قرار داشته و اساس تولید اسپرم بوده و عمل کرد بیضه هم وابسته به تکثیر و تمایز آنها است (13).

اساس SSCS در توانایی منحصر به فرد آنها برای خود نوزایی و تولید سلولهای تمایز یافته اسپرماتوگونی است، که در نهایت اسپرماتوزوآ را شکل می­دهند. این سلولها باسلولهای سرتولی و با اسپرماتوگونی­هایی که در حال تمایز هستند ارتباط نزدیکی دارند (46). علت اصلی تنظیم SSCS را می­توان سلولهای ناشی از سرتولی نیز نام برد. زیرا آنها تعامل نزدیکی با اسپرماتوگونی نوع A دارند (46). خودنوزایی SSCS و تمایز و تفکیک آنها در تقویت و حمایت باروری نقش عمده­ای را ایفا می­ کنند (75) . این عمل باعث بقای نسل در جنس مذکر می­ شود (67).

از آنجایی که سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی، اساس و پایه ساخته شدن اسپرم هستنند، بنابراین باعث شکل­ گیری اسپرم بالغ در جنس نر می­ شوند (75). لذا هر گونه اختلال در این فرایند، منجر به ناباروری خواهد شد (13).

این گونه اختلالات از طریق آسیب­های مختلفی، نظیر سرطان، شیمی درمانی، رادیوتراپی، جهش های ژنتیکی، اثرات منفی ناشی از پیر شدن سلولها و سموم مختلف ایجاد می ­گردد. آسیب های این چنینی موجب می­ شود تا تقسیمات میتوزی در برخی از این سلولها متوقف شده و بر روی روند اسپرماتوژنزیس اثر منفی بگذارد و نهایتا باعث گردد تا باروری دچار اختلال شود (64).

اسپرماتوگونی (گونه ای ازسلولهای بنیادی در انسان) :

در داخل لوله های اسپرم ساز، سلول های ژرمینال اولیه (PGC)[5] و همچنین سلولهای سرتولی وجود دارند. اندکی پس از بلوغ،PGC به سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی تبدیل شده و اسپرماتوگونی نوعA از مجموعه سلول های بنیادی مشتق می گردد.

اسپرماتوگونی نوعA به دودسته A Pale وA dark تقسیم می‌شود. سلولهای نوع A dark، سلولهای خاموش یا سلولهای بنیادی اسپرماتوگونی بوده و تنها در صورت آسیب فعال می شوند. در حالی که سلولهای A Pale تنها قادر به تکثیر و تشکیل سلولهای تمایز یافته می باشند.

سلولهای A dark در ابتدا به سلولهای A Pale تبدیل شده و به دنبال آن، رده های دیگر سلول زاینده تمایز می یابند. پس از تشکیل A pale با تقسیمات میتوزی اسپرماتوگونی نوع B ایجاد شده و این نوع اسپرماتوگونی نیز با آخرین تقسیم میتوزی تبدیل به اسپرماتید اولیه می‌شوند. سپس با تقسیم اولین مرحله از میوز، اسپرماتوسیتهای ثانویه شکل می گیرند. سپس طی تقسیمات دومین مرحله میوز، این سلولها بلافاصله شروع به تشکیل اسپرماتید می کنند (19).