دانشمندان تلاش می‌کنند که روش‌های جدید افزایش تولید مواد غذایی برای جمعیت همواره در حال رشد بشر را پیدا نمایند، ولی متاسفانه خسارت زیاد قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی به محصولات غذایی هنوز هم انکار ناپذیر است. امروزه کاربرد ترکیبات شیمیایی به عنوان ارزان‌ترین و متداول‌ترین روش کنترل بیماری‌های گیاهی مورد توجه است ولی این مواد معمولا در طبیعت به کندی تجزیه می‌شود و به همین دلیل باعث ایجاد مسمومیت برای انسان و جانواران اهلی و سایر موجودات زنده می‌شود (کارامان[1] و همکاران .2001).

جامعه بشری برای تولید فرآورده‌های کشاورزی با دشواری و بحران خاصی روبرو گردیده است. همچنین افزایش جمعیت نیاز به تولید مواد غذایی را افزایش داده است. دسترسی به این هدف با افزایش سطح زیر کشت، افزایش عملکرد در واحد سطح و حفظ محصول امکان‌پذیراست. از طرف دیگر استفاده از روش‌های شیمیایی به منظور کنترل آفات و بیماری‌های گیاهی سلامت محیط زیست را به خطر می­اندازد. اگر چه این سموم در مبارزه با بیماری‌ها در کوتاه مدت نتایج موثری به همراه داشته اند، اما به تدریج اثرات سوء آنها بر انسان، موجودات زنده و محیط زیست آشکار گردیده است. روش‌های مختلفی مانند کنترل بیولوژیک و استفاده از عصاره‌های گیاهان دارویی به منظور رفع این مشکلات توصیه شده ­اند. در این میان استفاده از عصاره‌های گیاهان دارویی به دلیل عوارض جانبی کمتر، عدم مقاومت پاتوژنی، پایین بودن هزینه تولید، تجزیه شدن در خاک و عدم آلودگی محیط زیست می‌تواند به عنوان جایگزین مناسب سموم شیمیایی مطرح شود (قاسمی[2]، 2010).

یكی از مهم‌ترین عوامل محدودكننده تولید، بیماری‌های گیاهی هستند. هر ساله بخش قابل توجهی از تولیدات گیاهی در اثر بیماری‌های گیاهی از بین می‌روند و این در حالی است كه بیش از 800 میلیون نفر در جهان از غذای كافی برخوردار نیستند. تركیبات شیمیایی كه به صورت مصنوعی تولید می‌شوند، علاوه بر آلودگی‌های زیست محیطی، سلامت بشر را نیز تهدید می‌كنند (افضل[3] و همکاران، 1997).

متأسفانه اغلب رویكرد‌هایی كه طی یكی دو قرن اخیر در كشاورزی اتخاذ شده با تولید پایدار، مغایرت دارد. استفاده مكرر و بی‌رویه از تركیبات شیمیایی، علاوه بر آلودگی محیط زیست، موجب بروز پدیده مقاومت در برابر آفت كش‌ها شده و در نتیجه پتانسیل خسارت آفرینی عوامل بیماری‌زا را به شدت افزایش می‌دهد (نارایان[4] سامی، 2002).

عوامل بیماری‌زای گیاهی در مقابل مواد شیمیایی آفت­کش مقاومت نشان می‌دهند و هر روز شاهد افزایش تعداد عوامل بیماری‌زای مقاوم به آنها هستیم، بنابراین نیاز به پژوهش در راستای کشف مواد جدید ضدقارچی که تجدید شونده سازگار با محیط زیست و به آسانی قابل تهیه باشد ضروری می کند (رمضانی[5] و همکاران، 2002).

کنترل زیستی عوامل بیماری‌زای گیاهی با هدف کاهش اثرات خطرناك آفت‌کش‌های شیمیایی از جمله تهدید سلامتی بشر، آلودگی محیط زیست، از بین بردن موجودات غیر هدف و پیدایش عوامل بیماری­زای مقاوم یک اولویت می‌باشد. در این راستا استفاده از پتانسیل ضد میکروبی متابولیت‌های گیاهی، طی سال‌های اخیر مورد توجه قرار گرفته است. مبارزه بیولوژیک به‌عنوان یک پدیده جدید چشم اندازه مناسبی را از خود نشان داده است. کشور پهناور ایران نیز به دلیل داشتن گذشته درخشان در زمینه دانش گیاهان دارویی، شرایط اقلیمی و اکولوژیک متنوع و وجود تنوع گونه‌ای و ژنتیکی فراوان گیاهی از شرایط بسیار مطلوبی در زمینه توسعه دانش گیاهان دارویی و تولید داروهای گیاهی در جهان برخوردار است (عبدالمالکی[6] و همکاران، 2011).

استفاده از تركیبات طبیعی در كنترل آفات و بیماری‌های گیاهی، یكی از راهكارهای كاهش مخاطرات زیست محیطی است. دراین راستا، پژوهش‌گران زیادی در سال‌های اخیر به مطالعه اثرات ضدباكتریایی، ضدقارچی و حشره­كشی اسانس‌ها و عصاره‌های گیاهی پرداخته‌اند (علام[7] و همکاران، 2007).

گیاهان معمولا توانایی دفاع از خود را با تولید انواع متابولیت‌های ثانویه شامل آلکالوئید‌ها، ترپنوئیدها، استروئیدها و دیگر ترکیبات آروماتیک که احتمالا برای دشمنان آنها نا مطلوب و یا حتی سمی‌اند را به‌دست آورده‌اند (لیو[8] و همکاران، 2001).

گیاهان بالغ بر هزار متابولیت ثانویه طبیعی با وزن مولکولی پائین تولید می‌کنند (دیکسون[9]، 2001). شناخت و بررسی این متابولیت‌ها می‌تواند كمك مؤثری به كنترل آفات و امراض بنماید (ازلان[10] و همکاران، 2003).

پژوهش‌ها نشان می‌دهد که برخی از این ترکیبات می‌تواند برای کنترل عوامل بیماری‌زای گیاهی و یا حداقل به عنوان مدلی برای ساخت ترکیبات آفت­کش‌های جدید مورد استفاده قرار گیرند (رسولی[11] و میرمصطفی، 2002).

مطالعه در زمینه وظایف این تركیبات در گیاهان، یک موضوع جذاب و مهم برای بسیاری از پروژه‌های تحقیقاتی شده است و نقش­های اكولوژیكی تعدادی از این تركیبات مورد بررسی و تحقیق قرار گرفته است، با مطالعاتی كه تاكنون صورت گرفته است، به نظر می‌رسد كه متابولیت‌های ثانویه، به عنوان موادی طبیعی، نقش های اكولوژیكی مهمی در واكنش‌های دفاعی گیاهان دارند. بسیاری از متابولیت‌ها در دفاع گیاه در مقابل آفات و امراض مؤثر می‌باشند (کاون[12]، 1999).

اسانس‌ها عصاره‌های گیاهی دارای تركیباتی با فعالیت‌های زیستی متفاوت هستند (رودریگویز[13] و همکاران، 2005).

در سال‌های اخیر شرکت‌های تجاری از نتایج یافته‌های پژوهشی در مورد خواص آفت­کشی اسانس‌های گیاهی استفاده نموده و ترکیبات آفت­کشی را به بازار عرضه نموده ­اند (لیو و همکاران، 2001).

استفاده از پتانسیل بالقوه مواد بیولوژیکی با اثرات ضدباکتریایی، ضدقارچی و حشره­کشی مورد توجه محققین زیادی قرار گرفته است (مویما[14] و همکاران، 2004).

تا کنون فعالیت ضد میكروبی و حشره­كشی اسانس و عصاره چندین گونه گیاه به خوبی شناخته شده و مورد استفاده قرار گرفته­اند، این روش مطالعه در مورد تركیبات طبیعی كه ممكن است منجر به كشف عوامل موثر در كنترل عوامل بیماری­زای گیاهی (باكتری­ها و قارچ­ها) شود، از اهمیت بسیار برخوردار است. اسانس ­های گیاهی گروهی از مواد موثره موجود در گیاهان هستند که خاصیت محافظت کنندگی بسیاری از آنها در برابر قارچ­ها، باکتری­ ها، ویروس­ها و انگل­ها از دیرباز شناخته شده و مورد استفاده قرار گرفته است. در سال­های اخیر به دلیل افزایش علاقه به مواد طبیعی و بالا رفتن سطح آگاهی مردم محققین با جدیت بیشتری به مسئله استفاده از اسانس ­ها و عصاره­ها پرداختند (عبدالملکی و همکاران، 1389).

قارچ Macrophomina phaseolina (Tassi) Goidanich بیمارگر تعداد زیادی از گونه­ های وحشی و زراعی در نواحی گرمسیری جهان می­باشد و عامل بیماری پوسیدگی زغالی، بلایت برگی، بلایت ساقه و مرگ گیاهچه است. قارچ عامل بیماری اولین بار در سال 1901 توسط تسائی به نام Macrophomina phaseolina معروف گردید. سپس دانشمندان دیگر بر اساس خصوصیات مرفولوژیکی نام­های متفاوتی را برای آن در نظر گرفتند معتبرترین نام انتخاب شده برای این قارچ Macrophomina phaseolina می­باشد که توسط گویدانیچ در سال 1974 انتخاب شد (بلانکولوپز[15] و جیمنزدیاز، 1983).

تاکنون از روش‌های مختلفی به منظور کنترل بیولوژیک قارچ ماکروفومینا فازالینا (Macrophomina phaseolina) استفاده شده است. یکی از موثرترین روش‌ها، استفاده از عصاره‌های گیاهان مختلف در کنترل این قارچ بوده است.

این مطالعه با هدف ارزیابی اثرات ضد قارچی چهار اسانس گیاهی شامل (رزماری، نعناع فلفلی، رازیانه اکالیپتوس) و همچنین اثر بازدارندگی نانو سیلور برقارچ ماکروفومینا انجام گرفت.

 بسیاری از مواد موثره گیاهان دارای جنبه دفاعی مستقیم یا غیرمستقیم هستند. با این حال تأثیر آسیب‌های مکانیکی و شیمیایی مثل زخم‌ها، آلودگی‌های ناشی از حیوانات شکارگر و علف­کش‌ها برعملکرد و اجزای متابولیت‌های ثانوی کمتر بررسی شده است. در شرایط طبیعی گیاهان متابولیت‌های خاصی تولید می‌کنند و زمانی که تحت تأثیر یک آسیب شیمیایی یا مکانیکی قرار گیرند تولید متابولیکی گیاه تغییر می‌کند و ممکن است ترکیبات جدیدی تولید کنند که نقش محافظتی در برابر آسیب وارده داشته باشند و به عنوان یک تولید القاء شده بررسی می­ شود. در Pinus pinaster مطالعات نشان داده است که بعد از زخم­زنی عملکرد اسانس گیاه 5/2 برابر افزایش می‌یابد. ضمن اینکه مایه­کوبی با میسیلیوم به افزایش 60 برابری عملکرد اسانس منتهی می‌شود. علاوه بر این افزودن میسیلیوم تغییرات معنی‌داری در درصد اجزای اصلی اسانس ایجاد می‌کند. بررسی تأثیر علف­کش‌ها بر نمو کرک‌ها و تولید کآزولن در بومادران نشان داده است که چندین نوع علف­کش نمو غده­های ترشحی کرک را به تأخیر انداخته و کرک‌هایی با تعداد سلول‌های 2 تا 3 برابر حالت طبیعی ایجاد می‌کنند. تولید آمازولن نیز مخصوصاً زمانی که 2-4-D، دی کامبا و تریازین استفاده شد کاهش یافت (فیگوئریدو و همكاران، 2008).

حمله پاتوژن­ها و آفات باعث ضعیف شدن گیاه می‌شود و بیومس را در واحد سطح کاهش می‌دهد. برای مثال قارچ خاکزی Verticilium dahlias عامل محدود کننده کشت نعناع فلفلی در آمریکا است. برای مقابله با آفات و بیماری­های مختلف، گیاهان تولید ترپنوئیدها و ترکیبات فرار که نقش دفاعی در برابر این عوامل دارند را بالا می­برند تا در برابر استرس ناشی از آن‌ ها مقاومت کنند، اما تولید اسانس در واحد سطح به علت کاهش رشد گیاه كم می‌شود. بررسی‌ها در گیاه Agastache anethiodora نشان داد که ویروس موزائیک خیار باعث کاهش عملکرد اسانس شد و مقدار نسبی اجزای اسانس را تغییر داد (فیگوئریدو و همكاران، 2008).

2-1 قارچ ماکروفومینا

قارچ M. phaseolina معمولا بر روی سیستم آوندی ریشه­ها و میانگره­های تحتانی تاثیر می­گذارد و نقل و انتقال مواد غذایی و آب را به سمت قسمت ­های فوقانی گیاه مختل می­سازد. این قارچ گیاهان را در تمام مراحل رشدی آلوده می­ کند. تحت شرایط مزرعه­ای قارچ عامل بیماری در طی مراحل ابتدایی رشد در گیاه گسترش می­یابد اما علائم بیماری تا زمان بلوغ ظاهر نمی­ شود. شرایط آب و هوایی نظیر دما و رطوبت یک نقش مهمی را در فعالیت و تکثیر M. phaseolina ایفا می­ کند و این نیازهای اپیدمیولوژی می ­تواند در جهت حمله به میزبان و توسعه علائم بارز نقش داشته باشد، اگر چه دامنه نیازهای دمایی و رطوبت نسبی به نوع ایزوله­ها، شرایط آب و هوایی منطقه و ارقام میزبان بستگی دارد (راجکومار[17] و ماهالینگ، 2007 ؛ ادموند[18]، 1964).

چنانچه رطوبت کم و دمای بالا غالب باشد قارچ ماکروفومینا در سراسر مراحل آلودگی گیاهچه سریعا میزبان را مورد حمله قرار داده و در بین 24 تا 48 ساعت در میزبان گسترش می­یابد (راجکومار و ماهالینگ، 2007 ؛ ادموند، 1964).

آلودگی اولیه بیماری در مرحله گیاهچه اتفاق می­افتد ولی معمولا تا زمان گلدهی به صورت پنهان باقی می­ماند (اسمیت[19] و کراویل، 1997).

علائم بارز در اواسط تابستان و در دماهای بالای 24 تا 30 درجه سانتیگراد و رطوبت پایین خاک ظاهر می­شوند. بخش­های هیپوکوتیل گیاهچه­های آلوده ممکن است در هنگام طویل شدن تغییر رنگ دهد و به رنگ قهوه­ای مایل به قرمز در می ­آید (اسمیت و کراویل، 1993).

خسارت قارچ ماکروفومینا به صورت تشکیل گیاهچه­های نامرغوب، مرگ گیاهچه از نوع Pre-emergence و Post-emergence و کاهش باروری گیاهان مسن­تر می­باشد. اگر آلودگی از طریق ریشه صورت می­گیرد در سطح و بالای خاک تغییر رنگ مشاهده می­ شود. قسمتی که دچار تغییر رنگ شده به رنگ قهوه­ای تیره تا سیاه در می ­آید و گیاهچه­های آلوده به ویژه در شرایط گرم و خشک ممکن است از بین بروند. در هوای خنک و مرطوب گیاهچه­های آلوده زنده می­مانند، ولی در طی مراحل زایشی حامل آلودگی پنهان هستند. علائم بیماری ممکن است مجددا در هوای گرم و خشک و یا تحت تاثیر علف­کش­ها ظاهر گردد. در گیاهان مسن­تر، حالت پوسیدگی زغالی بعد از اواسط فصل ظاهر می­ شود. چنانچه آلودگی در اوایل رشد گیاه اتفاق بیافتد، ابتدا گیاهان آلوده برگ­های کوچکتر از برگ­های طبیعی تولید کرده که استحکام خود را سریع از دست می­دهند. در مرحله پیشرفته­تر، برگ­ها به رنگ زرد در آمده و پژمرده می­شوند، اما متصل باقی می­مانند گاهی لکه­های سطحی ساقه از سطح

خاک به سمت بالا امتداد می­یابد (اسمیت و کراویل، 1993).

پس از گل­دهی یک تغییر رنگ خاکستری روشن یا نقره­ای در بافت اپیدرمی یا زیر اپیدرمی، در ریشه­ اصلی و قسمت ­های پایینی ساقه ظاهر می­ شود. میکرواسکلروت­های سیاه رنگ قسمت ­های بیرونی بافت ساقه و بافت آوندی ساقه را احاطه می­ کنند و ممکن است مسیرجریان آب را مسدود کنند این میکرواسکلروت­ها ممکن است به اندازه­ای زیاد باشند که در بافت زیر اپیدرم رنگ خاکستری شبیه حالتی که پودر زغال روی آنها پاشیده شده باشد، ایجاد می­ کنند. ساقه ترک می­خورد، پوک و توخالی می­ شود و مغز ساقه از بین می­رود. طبق­های آلوده کج و بدشکل می­شوند و در طبق­های آلوده گل­های مرکزی عقیم می­شوند (ورمس[20] و همکاران، 2011).

در آلودگی­های بذری، بذرهای آلوده ممکن است فاقد علائم باشد یا دارای لکه­های سیاه نامشخص به همراه تغییر شکل روی پوسته بذر باشد. گیاهچه­های حاصل از بذرهای آلوده می­توانند همراه با علائم یا بدون علائم، آلوده شوند. گیاهچه­های آلوده از رشد باز می­مانند و تحت تاثیر مرگ گیاهچه قرار می­گیرد (سینکلر[21] و بکمن، 1993).

علائم عمده روی گیاهان آلوده به صورت کوتولگی (Stunting)، زردی و کلروز، پیری زودرس، از بین رفتن گیاهان قبل از موعود، پژمردگی و انسداد و از بین رفتن سیستم آوندی می­باشد (ابوی[22] و پاستور، 1990).

علائم تیپیک بیماری به صورت زخم­های طویل سیاه یا خاکستری، خسارت برگ قبل از موعود و در نهایت کاهش کمیت و کیفیت بذر می­باشد (کلود[23] و روپ، 1999).

2-2- طیف میزبانی

قارچ M. phaseolina دارای طیف میزبانی بسیار وسیع است، به طوری که بیش از 500 گونه متعلق به 75 خانواده گیاهی را مورد حمله قرار می­دهد. بیشترین گیاهان میزبان در خانواده Poaceae، Brassicaceae، Solanaceae، Leguminosae، Composite قرار دارند (پورکایاستا[24] و همکاران، 2006).

از میان گیاهان مهم دانه روغنی، صنعتی، حبوبات و علوفه­ای که به عنوان میزبان­های این قارچ به شمار می­آیند می­آیند می­توان به موارد زیر اشاره کرد:

آفتابگردان (Helianthus annuus)، سویا (Glycine max)، گلرنگ (Carthamus tinctorius)، کنجد (Sesamum indicum)، ذرت (Zea mays)، بادام زمینی (Arachis hypogea)، پنبه (Gossypium hirsutum)، چغندرقند (Beta vulgaris)، نخود ایرانی (Cicer arietinum)، لوبیا (Phaseolus vulgaris)، باقلا (Vicia faba)، لوبیای سفید (Phaseolus lunatus)، سورگوم (Sorghom bicolor)، شبدر (Trifolium pretense)، یونجه (Medicago sativus)، گندم (Triticum aevtivum) (میهالی[25]، 1992).

از درختانی که به عنوان میزبان­های این قارچ گزارش شده ­اند شامل گونه­ های مرکبات (Citrus spp)، گونه­ های کاج (Pinus spp)، گونه­ های آلو (Prunus spp)، کاج سیاه (Larix gmelinii) و زیتون (Olea europea) می­باشد. در ایران قارچ عامل بیماری علاوه بر آفتابگردان روی سویا، کنجد، ذرت، کیوی، بامیه، خربزه، طالبی، خیار، گوجه فرنگی، بادمجان، بقولات و زیتون گزارش شده است (مهدی­زاده و همکاران، 1388).

از بین گیاهان سبزی و صیفی و جالیز که به عنوان میزبان­های این قارچ گزارش شده ­اند، می­توان بادمجان (Solanum melongena)، گوجه فرنگی (Lycopersicum esculentum)، سیب زمینی (Solanum tubersum)، سیب زمینی شیرین (Impomoea batatas)، فلفل (Capsicum annum)، کلم (Brassica oleracea)، کاهو (Lactuca sativa)، هویج (Dacus corvata)، خربزه (Cucumis melo)، خیار (Cucumis sativus)، توت فرنگی (Fragaris sp)، گل جعفری، مارچوبه، هندوانه، طالبی، شلغم و تربچه را نام برد (میهالی، 1992).

2-3- مکانیزم آلودگی و بیماری­زایی

قارچ M. phaseolina به وسیله مکانیزم اعمال فشار و لوله تندش یا به وسیله تخریب و انحلال دیواره سلولی از طریق ترشح توکسین­ها یا آنزیم­ها به درون بافت نفوذ می­یابد (ویلر، 1975).

قارچ عامل بیماری یک تعدادی از فیتوتوکسین­ها مانند آسپرلین[26] (Asperlin)، ایزواسپرلین[27]، فومالاکتون[28]، فازئولینیک اسید[29]، فومنون[30]و فازئولینون را تولید می­ کنند (دهار[31] و همکاران، 1982 ؛ باتاچاریا[32] و همکاران، 1992).

فازئولینون دارای اهمیت زیادی می­باشد و ظهور علائم بیماری را در گیاه تحریک می­ کند (باتاچاریا و همکاران، 1992).

نقش مستقیم توکسین­ها در تحریک بیماری­زایی به وسیله M. phaseolina توسط کن بررسی شده بود (چان[33]، 1969).

تخریب دیواره سلولی به وسیله M. phaseolina ناشی از آنزیم­ های پلیگالاکتوروناز و سلولاز می­باشد. قارچ M. phaseolina می ­تواند تا بیش از 5-10 میکرون به درون غشای مومی شکل نفوذ کند (ویلر، 1975).

ایجاد آلودگی قارچ ماکروفومینا در خاک به واسطه میکرواسکلروت­های آن می­باشد. این اندام­ها از نظر متابولیکی غیر فعال بوده و فقط در صورت مجاورت و تماس با ریشه و طوقه گیاه میزبان جوانه زده و پس از تولید هیف اندام­های گیاهی را سریعا کلونیزه می­ کنند ولی ممکن است ریشه و ساقه ظاهرا سالم به نظر آید (اعتباریان و همکاران، 1379).

نفوذ هیف ابتدا به صورت برون سلولی است و سپس به صورت درون سلولی و برون سلولی انجام می­ شود. رشد میسیلیومی قارچ در ناحیه زیر سلول­های اپیدرمی، تا زمانی که هیف­های آن به ناحیه کرتکس برسند، ادامه می­یابد. در این ناحیه رشد قارچ ابتدا منحصر به فضای بین سلول­ها بوده ولی بعد از گسترش قارچ و کلونیزه کردن ناحیه کرتکس، تهاجم به صورت درون سلولی انجام می­ شود. در این مرحله اندامک­های قابل مشاهده در سلول­های میزبان ناپدید می­شوند و اسکلروت­ها داخل سلول تشکیل می­شوند (سینکلر و بکمن، 1993).

در مرحله آلودگی و هم زمان با تشکیل اسکلروت­ها مواد پکتینی و سلولزی سلول میزبان به سرعت تجزیه شده و مقدار آنها شدیدا کاهش می­یابد. در حالی که هیچ کاهشی در مواد لگنینی در محل آلودگی مشاهده نمی­ شود (سینکلر و بکمن، 1993).

با کامل شدن و بلوغ میکرواسکلروت­ها در داخل سلول­های میزبان غالبا شکاف­هایی در دیواره سلولی به وجود می­آید. اسکلروت­های بالغ از نظر متابولیکی غیر فعال می­باشند و زندگی آن مستقل از میزبان است. با توجه به اینکه تشکیل اسکلروت­ها ابتدا در بافت­های سبز آغاز و تعداد آنها در بافت­های مرده افزایش می­یابد می­توان گفت تبدیل تدریجی مرحله میسلیومی قارچ به مرحله اسکلروتی منجر به زوال تدریجی گیاه می­گردد (سینکلر و بکمن، 1993).