فرایند انجماد و ذوب اسپرم شامل در معرض قرار گرفتن ابتدایی اسپرم با مواد محافظ انجمادی، کاهش­دما به زیرصفر درجه سلسیوس، ذخیره، ذوب و سرانجام حذف ماده محافظ انجمادی و بازگشت به حالت طبیعی است. این تغییرات باعث آسیب­های ساختاری و بیوشیمیایی به اسپرم می­ شود که می ­تواند زنده­مانی و باروری اسپرم را تحت تاثیرقرار دهد. هدف از این پژوهش، بررسی اثر سطوح مختلف لسیتین(5/0، 1، 5/1 و 2 %) و زرده تخم مرغ(10، 15، 17 و 20 %) در رقیق­کننده پایه تریس- فروکتوز (همراه با 5 درصد گلیسرول) پس­ازفرایند انجمادو یخ‌‌گشایی بود. نمونه‌های منی توسط واژن مصنوعی از 4 راس قوچ افشاری بالغ، هفته­ای 2 بار جمع­آوری شد. نمونه­های منی رقیق شده در معرض بخار ازت منجمد و در تانک حاوی ازت مایع ذخیره شد و سپس یخ­گشایی پایوت­های حاوی اسپرم در آب گرم 37 درجه سلسیوس انجام شد. تحرک­کل­وتحرک پیشرونده اسپرم با کمک سامانه آنالیز رایانه‌ای اسپرم اندازه ­گیری شد. سلامت غشا، درصد اسپرم­های زنده و مورفولوژی اسپرم­ها بعد از فرایند یخ­گشایی اندازه ­گیری شد. نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد که رقیق‌کننده حاوی 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ در مقایسه با سایر سطوح­های آزمایشی موجب بهبود معنی­دار­ در میزان تحرک­ کل، تحرک پیشرونده، یکپارچگی­غشا و اسپرم­های­زنده شد (01/0p < ). سطوح مختلف لسیتین و زرده تخم مرغ اثر معنی­داری روی مورفولوژی اسپرم­ها نداشتند (05/0p > ). مطابق با نتایج این پژوهش به نظر می‌رسد که افزودن 5/1% لسیتین و 15% زرده تخم­مرغ به رقیق‌کننده ­های انجماد اسپرم قوچ افشاری باعث بهبود معنی­دار فراسنجه­ های اسپرم از جمله تحرک و درصد اسپرم­های زنده میشود.

فصل اول: کلیات

1-1- پرورش گوسفند

پرورش گوسفند در ایران دارای قدمت تاریخی بسیار طولانی­می­باشد که هم اکنون ایران با داشتن 55 میلیون راس گوسفند، در رتبه چهارم جهان قرار دارد. اما متاسفانه به علت عدم بازده تولید مثلی و عدم استفاده از تلقیح مصنوعی در صنعت پرورش گوسفند، صرفه اقتصادی خوبی از این صنعت به دست نیامده و رشد چندانی نکرده است. بنابراین این مطالعه در مرحله اول به منظور انجماد منی قوچ با رقیق کننده­ های بر پایه منشا گیاهی(لسیتین سویا) و حیوانی(زرده) برای بهبود کیفیت مناسب اسپرم بعد از فرایند انجماد-ذوب و در مرحله دوم به منظور ارزیابی­عملکرد این رقیق کننده­ها با تست‌های­آزمایشگاهی مهم­مرتبط با توان باروری اسپرم صورت گرفت. نتیجه استفاده از این تست­ها، انتخاب رقیق کننده مناسب برای انجماد منی قوچ برای استفاده در تلقیح مصنوعی و انجام آسان برنامه ­های اصلاح نژادی و در نهایت گسترش پرورش گوسفند و اقتصادی بودن آن خواهد شد.

2-1- حفظ انجماد منی

حفظ انجماد منی و تلقیح مصنوعی فواید زیادی را برای صنعت پرورش حیوانات اهلی، به ویژه برای بهبود تولید مثلی و ژنتیکی­ارائه می­ کنند. اما بزرگترین مانع در حفظ انجماد منی، آسیبی است که به ساختمان اسپرم در طول فرایند انجماد- ذوب وارد می­ شود که منجر به باروری ضعیف اسپرم منجمد می­گردد (بارباس و همکاران، 2009). در طول سال­های اخیر، ابداع و توسعه­ انواع رقیق کننده­ های منی جهت انجماد اسپرم و در نتیجه افزایش راندمان و موفقیت تلقیح مصنوعی گسترش زیادی پیدا کرده است. لذا محققین مطالعات گسترده­ای برای تولید رقیق کننده­ هایی که بتوانند باعث حفظ انجمادی اسپرم شوند، انجام دادند. از مهمترین مزایای منجمد کردن منی قوچ، می­توان به بارور نمودن همزمان تعداد زیادی میش با بهره گرفتن از اسپرم قوچ­های با نژاد برتر و چندقلوزا، انتقال­آسان منی­از مراکز تولید و جمع­آوری به دورترین دامداری­ها، انجام زایش­خارج از فصل تولید مثلی، جلوگیری از انقراض گونه­ های در معرض خطر اشاره نمود (سالامون و مکسول، 2000).

در تحقیقات مرتبط با حفظ انجماد منی، بسیاری از مطالعات بر تشخیص آسیب­های وارد شده به اسپرم در طول فرایند انجماد- ذوب تمرکز نموده ­اند(تریمچ و همکاران، 1997: مدیروس و همکاران، 2002). در حالی­که، مطالعات فراوان دیگری نیز به استفاده از محافظت کننده‌های مختلف در رقیق کننده منی برای جلوگیری یا کاهش این آسیب­ها، برای بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرایند انجماد-ذوب تاکید کرده‌اند(تساک ماکدیس، 2010: فیزر و همکاران، 1984 ). بیشتر ارزیابی­های آزمایشگاهی که برای سنجش کیفیت منی استفاده می‌شود، همبستگی بالایی با توان باروری اسپرم ندارند. استفاده از رنگ­های فلورسنت با بهره گرفتن از میکروسکوپ فلورسنت و دستگاه فلوسایتومتری، تجزیه­و تحلیل گسترده­تری از پارامترهای اسپرم مانند زنده مانی، یکپارچگی­غشا و DNA، وضعیت آکروزوم، کروماتین­وظرفیت­دارشدن، عملکرد میتوکندری و تغییرات ساختاری (آپوپتوزیس) اسپرم را فرآهم نموده است (گراهام، 2001).

در بحث رقیق کننده منی برای جلوگیری بهتر از آسیب انجمادی[1] به کیفیت اسپرم، محافظت کننده­ های انجمادی[2] مختلفی برای انجماد اسپرم در چند دهه گذشته استفاده شده است(کری و همکاران، 2000: واتسون، 1976). کیفیت اسپرم پس از ذوب، به دلیل وقوع شوک سرمایی و تنش اسمزی در طی فرایند انجماد- ذوب کاهش می­یابد(سالامون و ویزر، 1972: بیلی و همکاران، 2000). بسیاری از این صدمات را می توان با رقیق کننده مناسب و مواد محافظ انجمادی مانع شد(گیل و همکاران، 200). ترکیبات موجود در رقیق کننده­ها باید بتوانند اسپرم را نسبت به شرایط متغیر بوجود آمده حفاظت نموده و حتی الامکان دچار صدمات کمتری کنند(هولت، 1997). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد حساسیت بالایی دارند، به طوریكه طی فرایند سرد شدن تنشی بر غشا اعمال شده که اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت.­­ در نتیجه­ این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده که منجر به مرگ آن می‌شود(پاپا و مکاران، 2011). علاوه بر این، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود.­ بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرم با كیفیت، بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد(هولت و همکاران، 1992). رقیق کننده­ های منی دارای خواص ویژه­ای هستند که موجب نگهداری طولانی تر اسپرم­ها می­شوند. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب‌های دمایی، کاهش استرس­های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن، انجماد-ذوب اسپرم­ها و در نهایت ایجادیک محیط مناسب برای زنده ماندن­ موقت اسپرم­ها نقش دارند(کری، 2000). گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن گلیکول دارای وزن مولكولی كم بوده و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده هستند و منابع لیپوپروتیینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده تخم مرغ، شیر یا لسیتین سویا برای جلوگیری از شوک سرمایی و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنی­ها مانند آنزیم­ها و آنتی بیوتیک­ها به رقیق کننده اضافه می­ شود(اماموردی و همکاران، 2013). منابع حیوانی مانند زرده تخم­مرغ، یک جزء طبیعی از رقیق کننده­ های منی است که غشای سلول اسپرم را در مقابل شوک سرمایی، در طول انجماد-ذوب محافظت می­ کند(واتسون، 1981). مکانیسم محافظتی توسط فسفولیپیدها (لسیتین) و لیپوپروتئین­های با چگالی پایین[3] انجام می­گیرد(ویدسور و وایت، 1997: موکه و همکاران، 2008). مطالعات قبلی نشان داد که اسپرم قوچ می ­تواند در برابر شوک سرمایی، با افزودن 15 درصد زرده تخم مرغ به رقیق کننده تریس محافظت شود(فیزر و همکاران، 1984). با این حال، زرده تخم مرغ ممکن است آنتاگونیست مواد محافظ انجمادی، حاوی آلودگی­های میکروبی و خطر انتقال بیماری­ها، تغییرات زیاد در ترکیبات آن­ها، دشواری مشاهدات میکروسکوپی و سبب ظرفیت دار شدن اولیه اسپرم باشد. پروتئین­های گیاهی مانند لسیتین سویا[4]، فاقد این ایرادات زرده تخم مرغ می­باشند.

در چند سال گذشته رقیق­کننده­ های جدید حاوی لسیتین­سویا برای جایگزینی زرده تخم­مرغ، به طور گسترده برای انجماد منی استفاده شده است(دل واله و همکاران، 2012: گیل و همکاران، 2003: فوکویی و همکاران، 2007). در نتیجه بهبود حفظ انجماد منی، به تشخیص آسیب­های وارده به کیفیت اسپرم و استفاده از رقیق کننده منی مناسب برای جلوگیری از آسیب­های انجمادی به اسپرم را در طی فرایند انجماد-ذوب می­طلبد.

بنابراین، هدف پژوهش حاضر، بررسی استفاده از سطوح مختلف لسیتین سویا (5/0، 1، 5/1و 2%) و زرده تخم مرغ (10، 15، 17 و20 %) و مقایسه آن­ها و انتخاب بهترین سطوح آن­ها برای استفاده در رقیق کننده منی قوچ، ارزیابی اثر آن بر خصوصیات جنبایی، زنده مانی و یکپارچگی غشای اسپرم قوچ در طی انجماد-ذوب می­باشد.در طول سال­های اخیر، پژوهش­های بسیاری روی بهبود حفظ انجمادی منی[5] قوچ برای گسترش تلقیح مصنوعی صورت گرفته است. بقا و تحرك اسپرم پس از انجماد–ذوب تحت تاثیر فاکتورهای متعددی از قبیل كیفیت منی، نوع و غلظت اجزای موجود در محیط انجماد منی از قبیل غلظت گلیسرول و یا سایر مواد محافظ کننده مانند منابع پروتئینی و لیپوپروتئینی است. این مواد در تأمین انرژی مورد نیاز، حفاظت اسپرم از آسیب­های دمایی، کاهش استرس­های فیزیکی و شیمیایی ناشی از سرد کردن و انجماد- ذوب اسپرم­ها و در نهایت ایجاد یک محیط مناسب برای حفظ کیفیت اسپرم­ نقش دارند. بنابراین استفاده از محیط انجماد مناسب منی قوچ که بتواند از اسپرم­ها در برابر آسیب­های انجماد- ذوب محافظت کند و بقا و تحرک اسپرم را بعد از انجماد- ذوب حفظ کند، گام مهمی در جهت استفاده از اسپرم منجمد در تلقیح مصنوعی گوسفند و مطالعات آزمایشگاهی است.

فرایند انجماد اسپرم اکثر PESTAN(به خاطر محدودیت سایت در درج بعضی کلمات ، این کلمه به صورت فینگیلیش درج شده ولی در فایل اصلی پایان نامه کلمه به صورت فارسی نوشته شده است)داران مستلزم گذراندن دو مرحله می­باشد. در مرحله اول که دوره خنک کردن[6] نامیده می­ شود، دمای منی رقیق شده از دمای 35-30 درجه به 5 درجه سلسیوس و در مرحله دوم که دوره منجمد کردن می­باشد، دمای منی رقیق شده از 5 درجه به 196- درجه سلسیوس در نیتروژن مایع کاهش داده می­ شود. در مرحله اول برای مقابله با شوک سرمایی، رقیق كننده­های سرمایی به منی اضافه می­گردد. این رقیق كننده­ها معمولا حاوی لسیتین، پروتئین­ها و لیپوپروتئین­های زرده تخم­مرغ می­باشند. در ابتدای مرحله دوم كه مرحله انجماد است، به منظور حفاظت اسپرم در مقابل صدمات ناشی از تشکیل بلورهای یخ، از رقیق كننده­های انجمادی كه حاوی 7-3 درصد گلیسرول است استفاده می­ شود که موجب حفظ اسمولاریته شده و ظرفیت بافری رقیق کننده را تامین می­ کند (دیپاز و همکاران، 2010: ویندسور و وایت، 1995). غشاهای سلولی در برابر آسیب ناشی از انجماد دارای حساسیت بالایی می­باشند به طوری كه در طی فرایند سرد شدن یک استرس حرارتی بر روی غشا ایجاد شده و منجر به تغییر کریستال مایع به فاز ژلی می­ شود که در نتیجه اثرات زیان آوری را به دنبال خواهد داشت. در نتیجه این تغییر، سلول ممکن است سوراخ شده و منجر به مرگ سلول ­شود. علاوه بر آن، این تغییر ممکن است منجر به تجزیه ترکیبات سطحی غشا شود (هولت، 1984). بنابراین حفظ سلامت غشا برای تولید اسپرماتوزواهای با كیفیت بعد از انجماد بسیار اهمیت دارد. کشف خصوصیات حفاظتی گلیسرول در حین انجماد اسپرم در سال 1949 میلادی توسط پولژ باعث شد که بتواند برای اولین بار اسپرم حیوانات را منجمد کند. اینکه چگونه گلیسرول باعث حفظ اسپرم در حین انجماد می­ شود یک پدیده کاملا شناخته شده است، چون هنوز هم در مورد مکانیسم عمل آن اختلاف نظر وجود دارد. گلیسرول قابلیت نفوذ پذیری بالایی داشته و اثر درون سلولی از خود نشان می­دهد. برای مثال اثر آبکشی شدید و بالای گلیسرول باعث کاهش تشکیل کریستال­های یخ درون سلولی می­ شود. مکانیسمی که گلیسرول باعث آبکشی و کاهش دمای انجمادی می­ شود به پتانسیل بالای پیوند آبی آن مربوط می­ شود که درنتیجه غلظت الکترولیت­های آزاد شده افزایش یافته و ساخته شدن کریستال­های یخ به تأخیر افتاده و یا مقدار آن کاهش می یابد که در نتیجه اسپرم در مقابل تغییرات فشار اسمزی و غلظت­های نمک محافظت می­ شود(مکلاگین و همکاران، 1992). علاوه بر گلیسرول، دی متیل سولفوکساید و اتیلن­گلایکول هم استفاده می­شوند که دارای وزن مولكولی كم هستند و عوامل محافظ انجمادی درون سلولی یا نفوذ کننده[7] نامیده می­شوند.

منابع لیپوپروتئینی یا مواد با وزن مولکولی بالا مثل زرده­ی تخم مرغ، شیر یا لسیتین­سویا برای جلوگیری از شوک سرما[8] و گلوکز یا فروکتوز به عنوان منابع انرژی و سایر افزودنی­ها مانند آنزیم­ها و آنتی بیوتیک­ها به رقیق کننده اضافه می­ شود(بلکشاو، 1995). برای تقویت رقیق­كننده­ها معمولا از تركیبات با منشا حیوانی نظیر زرده تخم­مرغ و شیر كامل استفاده می­ شود. این رقیق کننده­ها قادرند احتیاجات مورد نیاز اسپرم را که در بخش­های قبلی ذکرشد، تامین کنند. زرده تخم مرغ نیز یک جزء معمول تشکیل دهنده محیط­های انجماد است و با عمل بر روی غشا سلولی، اسپرم را در برابر شوک سرما محافظت می­ کند، اما این رقیق کننده­ها مشکلاتی نیز با خود دارند به طوریکه درسال­های اخیر بحث­های زیادی را به خود اختصاص داده­اند. یکی ازاین مشكلات، تغییرات زیاد درترکیبات آن­هاست به طوریکه استاندارد سازی هر یک از اجزای وی‍ژه و مفید موجود در آن رقیق كننده بر خصوصیات انجمادی اسپرم را با مشکل مواجه می­ کند. علاوه بر این زرده تخم مرغ و شیر ممکن است حاوی آلودگی­های میکروبی باشند که با تولید سموم، ظرفیت باروری اسپرماتوزوا را شدیدا کاهش داده و حتی باعث از بین رفتن آن­ها شوند و از همه مهمتر اینکه باعث انتقال بیماری­هایی مثل آنفولانزای مرغی شوند. از دیگر مشکلات زرده­ی تخم مرغ وجود مواد مضر از قبیل پروژسترون است که سبب ظرفیت دار شدن زود هنگام[9] اسپرم در طی انجماد می­ شود. در محیط دارای زرده­ی­تخم مرغ به علت وجود مواد اضافی، مشاهدات میکروسکوپی اسپرم دشوار است. همچنین مواد موجود در زرده سبب مهار تنفس اسپرم­ها یا کاهش تحرک آن­ها می­ شود و نیز سموم اندوتوکسین تولیدی توسط آلودگی­های موجود در زرده تخم­مرغ باعث کاهش باروری اسپرم می­ شود. بنابراین آلودگی­های مایکوپلاسمایی و باکتریایی موجود در منابع حیوانی مورد استفاده در انجماد منی و گسترش منی­های منجمد گونه­ های مختلف در سطح جهان همواره نگرانی گسترش بیما‌ری‌هایی مانند جنون گاوی و آنفلوآنزای مرغی را در سطح جهان در پی داشته است(ابوگلا و همکاران، 2004: امیرات و همکاران، 2004). فراوانی منابع گیاهی و عدم وجود آلودگی منابع گیاهی این ضرورت را ایجاد می­ کند که این منابع جایگزین منابع حیوانی گردد، به طوریکه منابع گیاهی به ویژه لسیتین­سویا در مطالعات زیادی برای انجماد اسپرم گونه­ های مختلف استفاده شده است که در فصل پیشینه تحقیق به طور کامل بررسی شده است.

¹ Cryoinjury

2 Cryoprotecrants

3 Low density lipoprotein (LDL)

4 Soybean lecithin

5 Semen cryopreservation

6 Cooling

7 Permeable cryoprotectant

8Cold shock

9 Early capacitation